Boire un café viennois avant de lire !

Les mutations activatrices mosaïques du gène GNAS sont responsables de la dysplasie fibreuse des os (DF) et du syndrome de McCune-Albright (MCA) qui associe une DF avec des hypersécrétions hormonales ± des taches café-au-lait. Si le diagnostic clinique de ce spectre de pathologie peut être compliqué, le diagnostic moléculaire l’est encore plus. Les mutations sont somatiques ou en mosaïque. Elles sont donc souvent absentes dans les leucocytes, en tout cas non mises en évidence par les techniques de séquençage par PCR conventionnelle. En effet, tout l’ADN d’un échantillon n’est pas amplifié avant sa lecture par le séquenceur, ce qui est appelé biais d’amplification.

Une nouvelle génération de PCR, la ddPCR (digital droplet PCR), existe. Elle consiste dans le portionnement de l’échantillon d’ADN en 20 000 gouttelettes par émulsion eau-huile. Les matrices présentes dans chacune des gouttelettes sont ensuite amplifiées par PCR individuelles. Le nombre de copies est alors “lu”, généralement par fluorescence, gouttelette par gouttelette (figure). Les résultats sont exprimés en pourcentage de variants.

Les auteurs japonais ont réalisé une analyse de GNAS par ddPCR sur leucocytes chez un patient atteint de MCA et dont la mutation activatrice p.R201H avait été préalablement mise en évidence dans le tissu thyroïdien. Ils ont pu montrer que la mutation était présente dans 9,4 % de l’ADN leucocytaire, alors que la PCR conventionnelle ne retrouvait pas la mutation. Ils ont pu calculer un seuil de détection d’une mutation par ddPCR à 0,2 %. Ils ont même amélioré ce seuil en réalisant une PCR emboîtée (ce qui va permettre de bloquer l’amplification des séquences wild-type) avant de réaliser la ddPCR. Le seuil de détection d’une mutation passe alors à 0,005 %.

Ces 2 techniques sont donc très séduisantes et efficaces pour identifier les événements moléculaires rares. Mais rendons à César ce qui est à César… L’équipe française d’Anne Barlier a déjà publié d’excellents résultats cette année sur l’utilisation de la ddPCR dans le MCA (PMID : 30442414).